- Регулируемая генная терапия(PubMed)
Автор:Людивин Брегер, Эрика Эльгстранд Веттергрен, Луис Квинтино, Сесилия Лундберг
Аннотация: Генная терапия представляет собой многообещающий подход к лечению моногенных и многофакторных неврологических расстройств. Его можно использовать для замены отсутствующего гена и мутировавшего гена или для подавления причинного гена. Несмотря на универсальность генной терапии, одно из основных ограничений заключается в необратимости процесса: после доставки в клетки-мишени интересующий ген конститутивно экспрессируется и не может быть удален. Таким образом, эффективная, безопасная и долгосрочная модификация генов требует системы, позволяющей точно контролировать экспрессию трансгена. За последние десятилетия были разработаны различные системы для регулирования экспрессии трансгена после доставки in vivo либо на уровне транскрипции, либо на посттрансляционном уровне. Цель этой главы — дать обзор современной системы регуляции, используемой в контексте генной терапии неврологических расстройств. Системы, использующие внешнюю регуляцию трансгенов с помощью антибиотиков, обычно используются для контроля либо экспрессии генов с помощью транскрипции, контролируемой тетрациклином, либо уровней белка с использованием технологии дестабилизирующих доменов. В качестве альтернативы также исследуются специфические промоторы генов, которые регулируются механизмами заболевания, увеличивая экспрессию по мере прогрессирования заболевания или снижая экспрессию по мере регрессии заболевания. В целом, в этой главе обсуждаются преимущества и недостатки современных молекулярных методов регулируемой генной терапии в центральной нервной системе.
2. Эффективная и быстрая точная замена гена без селекции (PubMed)
Автор: Фредерик Р. Кросс, Крести Пекани
Аннотация: мы описываем высокоэффективный метод точной замены генов у почкующихся дрожжей. Индукция быстрой и эффективной рекомбинации во всей клеточной популяции приводит к тому, что по крайней мере 50% рекомбинантов подвергаются переключению эндогенной копии на конкретный мутантный аллель без оставшихся маркеров или остатков чужеродной ДНК без отбора. Для этого частичная копия замещающего аллеля, за которой следует участок разреза HO, устанавливается рядом с локусом дикого типа на фоне GAL-HO MATa-inc. Индукция HO приводит к почти количественному расщеплению сайта и рекомбинации/конверсии генов, что приводит либо к регенерации аллеля дикого типа, либо к переключению эндогенного аллеля на мутантный с сопровождающей делецией промежуточных маркерных последовательностей, что приводит к точной замене. Устранение необходимости отбора (в течение нескольких дней) редких рекомбинантов устраняет опасения по поводу супрессорных мутаций второго сайта, а также позволяет проводить прямой фенотипический анализ даже летальных замен генов без необходимости в методе, обусловливающем летальность, или в использовании регулируемых промоторов неизвестная сила по сравнению с эндогенным промотором. Чтобы протестировать этот метод, мы попробовали две известные летальные замены гена, заменив несущественный ген CDH1 доминантно летальной версией, мутировавшей по его сайтам фосфорилирования Cdk, и заменив незаменимый ген CDC28 двумя рецессивно летальными версиями, одна из которых содержит ранний стоп-кодон, а другая — две рецессивно летальные версии. другая инактивирующая активность киназы Cdc28. Мы также проверили замену гена с неизвестными фенотипическими последствиями: замена несущественного циклина CLB3 B-типа версией, лишенной его блока разрушения.
3. Двойная целенаправленная замена генов для создания нулевых мутантов(PubMed)
Автор: Эй Круз, К. М. Коберн, С. М. Беверли.
Аннотация: Мы использовали двойное нацеливание генов для создания гомозиготных замен генов у простейшего паразита Leishmania major, бесполого диплоида. В этом методе используются два независимых селектируемых маркера в последовательных раундах нацеливания генов для замены обоих аллелей эндогенного гена. Мы разработали улучшенную кассету устойчивости к гигромицину B, кодирующую гигромицинфосфотрансферазу (HYG), для использования в качестве селектируемого маркера Leishmania. HYG-содержащие векторы функционировали эквивалентно тем, которые содержат кассету неомицинфосфотрансферазы (NEO), ранее использовавшуюся для внехромосомной трансформации или нацеливания на гены. Устойчивость к лекарственным средствам, придаваемая маркерами NEO и HYG, была независимой, что позволяло проводить одновременный отбор по обоим маркерам. Нацеленный вектор HYG использовали для замены единственного гена дигидрофолатредуктазы-тимидилатсинтазы (DHFR-TS), оставшегося в линии, гетерозиготной по замене NEO в локусе dhfr-ts (+/neo), с эффективностью нацеливания, сравнимой с наблюдаемой. с реципиентами дикого типа. Полученная линия dhfr-ts- (hyg/neo) была ауксотрофной по тимидину. Метод двойной направленной замены позволит проводить функциональное генетическое тестирование различных бесполых диплоидов, включая культивируемые клетки млекопитающих и грибы, такие как Candida albicans. Кроме того, возможно использование Leishmania, несущего условно ауксотрофные замены генов, в качестве безопасных улучшенных живых вакцин против лейшманиоза.
